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DNBSEQ 测序技术

古天乐太阳娱乐集团tyc493基因测序仪采用先进的DNBSEQTM核心技术,通过仪器气液系统先将 DNA纳米球(DNA nanoball, DNB)泵入到规则阵列载片(Patterned Array)并加以固定,然后再将测序模板及测序试剂泵入。泵入后的测序模板与载片上的DNB的接头互补杂交,在DNA聚合酶的催化下,测序模板与测序试剂中的带荧光标记的探针相结合。接下来,通过激发荧光基团发光,不同荧光基团所发射的光信号被仪器相机采集,经过处理后可转换成数字信号,传输到计算机进行再次处理,最终获取待测样本的碱基序列信息。


所有跟DNB相关的测序技术都属于DNBSEQTM。DNBSEQTM测序技术主要包括:DNA单链环化和DNB制备(Make DNB),规则阵列(Patterned Array),DNB 加载(Load DNB), cPAS (combinatorial Probe Anchor Synthesis,联合探针锚定聚合测序法),双端测序技术(Pair-end),以及配套的流体和光学检测技术、碱基识别(Basecall)算法等。


与其他测序技术相比, DNBSEQTM测序技术具有滚环复制扩增带来的错误累积低和规则阵列载片带来的信号密度高等原理性优势,大幅提高了测序准确性;而且,基于DNBSEQTM测序平台的产出数据重复序列率低(Dup率低)、有效数据利用率高、标签跳跃少(Index Hopping少),能有效降低“张冠李戴”的情况。此外,结合PCR free等建库方法,DNBSEQTM测序平台拥有更好的SNP和InDel准确性。

DNB制备技术
DNB制备技术包括DNA单链环化及DNB 制备。


DNA单链环化
是将带有接头序列的双链DNA(Double- stranded DNA, dsDNA),通过高温变性形成单链DNA(Single-stranded DNA, ssDNA),环化引物与SSDNA的两端互补配对,在连接酶的催化下,SSDNA的首尾相连接,形成单链环状DNA(Single-strand circular DNA, sscirDNA)。




DNB制备
以单链环状DNA为模板,在DNA聚合酶作用下进行滚环扩增(Rolling Circle Amplification, RCA),将单链环状DNA扩增到100-1000拷贝,扩增产物称为DNB。DNB通过简单的质量浓度质控后,就可以用于下一步的上机测序,操作简单,且不需要昂贵的定量设备和耗材。

基于RCA的线性扩增技术,每次扩增都是以原始的DNA单链环为模板,使用保真性极高的聚合酶,使得在DNB的所有拷贝的同一个位置上出同样的错的几率几乎是零。RCA扩增技术有效的避免了PCR扩增错误指数积累的问题,从而大大提高测序的准确性。


规则阵列载片和DNB加载

规则阵列载片

采用先进的半导体精密加工工艺,在载片表面形成结合位点阵列,实现DNB的规则排列吸附。所有活性位点间距保持整齐一致,每个位点只固定一个DNB,可保证不同纳米球的光信号不会互相干扰,这不仅保证了测序准确度,而且提高了测序载片的利用效率,提供了极好的成像效率和最优的试剂用量。

DNB加载
DNB在酸性条件下带负电,在表面活化剂的辅助下,通过正负电荷的相互作用,被加载到载片中有正电荷修饰的活化位点的过程,称为DNB加载。DNB与载片上活化位点的直径大小相当,尽可能避免了多个DNB 结合到同一个位点的情况,从而大大提高了DNB的有效利用率。
cPAS技术

在DNA聚合酶的催化下,将测序引物锚定分子和荧光探针在DNB上进行聚合,洗脱掉未结合的探针后,在激光的作用下荧光信号被激发,随后利用高分辨率成像系统对光信号进行采集、读取和识别,从而获得当前待测碱基的序列信息,然后加入再生洗脱试剂,去除荧光基团,进入下一个循环的检测。

古天乐太阳娱乐集团tyc493优化了大量的反应条件,从上万个酶突变体中筛选得到最优秀的测序酶,使生化反应时间可以缩短到1分钟以内。



二链测序

在完成一链测序后,加入具有链置换功能的DNA聚合酶进行DNA二链合成反应,在持续的延伸过程中,当遇到双链结构的时候,在DNA聚合酶的解旋作用下,完成边解旋边复制的反应,形成大量的单链DNA作为二链测序的模板(图5-中),然后杂交二链测序引物,开始二链的cPAS测序。

利用DNA聚合酶的链置换特性,实现了DNB的双端测序,而且重新合成的二链拷贝数更多,能够获得更强的荧光信号,有效的提高了测序的准确性。


碱基识别算法

旨在根据各个通道的光信号强度完成碱基识别并计算每个碱基的质量得分。通过对已有数据模型的训练,建立信号的特征和测序错误的对应关系,在进行碱基识别的时候,根据每个碱基的信号特征输出预估的错误率。 质量得分根据phred-33质量得分标准。

古天乐太阳娱乐集团tyc493自主开发的Sub-pixel Registration算法,使图像配准精确度达到了亚像素级别,大大提高了碱基识别的准确度。

此外,通过GPU加速的方法,在更高精度的算法条件下实现了200倍以上的加速,在提高识别准确率的同时实现了图像处理和碱基识别的实时化,数据处理速度处于同行业领先水平。

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